之後羽柴秀吉攻下因幡，隨後攻下巖屋城，奪取淡路，明智光秀大喜，隨後派去使者與長宗我部家談和，作爲四國方面攻略的軍團長，輕鬆拿下四國必定可以得到織田信長的獎賞。
上一年，明智光秀跟着織田信長到了甲斐的躑躅崎館，說了一句：到達這裡，我們的努力真是沒有白費。
這句話惹怒了織田信長，織田信長怒罵明智光秀：你做什麼努力嗎？隨後讓森蘭丸敲了明智光秀的腦袋。
天正十年，二月，織田信長決定在京都閱兵，同時邀請了武田正信和德川家康。
二十八號，織田信長於京都天皇內殿的東邊馬場舉行一大展示，即所謂的京都軍馬演練，此演練爲以信長爲首的織田家一門、丹羽長秀、山內一豐等織田軍團的軍容展示。
同樣還有武田正信的近衛軍，以及德川家康的三河勇士。
此時的軍馬演練，正親町天皇亦有出席。
此時在紀州的雜賀衆開始內部分裂，支持信長派的鈴木孫一與反信長派的土橋平次等人互相爭鬥，導致雜賀衆勢力衰退。
接着針對高野山於1581年藏匿荒木村重殘黨與足利義昭密通等與信長爲敵的動作，信長派出數十名使者欲和平地解決此事，而高野山方面卻不合理地將信長派去的使者全部殺害。
被激怒的信長逮捕織田領地中數百名高野山僧人，並命令河內、大和的各大名包圍高野山，高野山上的人活活餓死。
到了六月，已經等的不耐煩的織田信長準備派三男神戶信孝、重臣丹羽長秀等軍團進攻四國的長宗我部元親。
明智光秀知道後大爲驚訝，又加上自己剛剛被撤職一時間有些心慌，隨後他的家臣直接告訴明智光秀造反，明智光秀沒有答應。
但是隨着家臣們的勸說，以及明智光秀自己的恐懼，他也下定了決心。
6月1日，信長援軍35000人出陣，其中包括出陣出雲、石見的明智光秀軍；自己僅帶不到100人，從安土城出發，當夜織田信長下榻京都本能寺，召來國手日海和尚（即本因坊算砂）和鹿鹽利玄對弈爲戲。據說此局下出了罕見的三劫連環無勝負局，包括信長在內，觀者皆驚。
當日晚間，信長召來長男織田信忠歡宴，宴後信忠返回妙覺寺就寢。
此時已有謀反之心的明智光秀回到居城和手下重臣齋藤內藏介利三、明智左馬介光春等商議，認爲自己取代信長的時機已經成熟。
當夜，明智軍13000餘人出陣。第一隊大將明智左馬介光春四天王但馬、村上和泉、三宅式部、妻木主計3700人。
第二隊大將明智治左衛門藤田伝五郎、並河掃部介、伊勢與三郎、松田太郎左衛門約4000人本隊總大將明智光秀明智十郎左衛門、荒木山城守、荒木友之丞、諏訪飛騨守、齋藤內藏介、奧田宮內、御牧三左衛門3200餘人。
天正10年6月1日半夜，明智軍到達京都。明智左馬介光春大喊一聲：“敵在本能寺！”隨後進攻織田信長泊宿的本能寺，明智治左衛門攻二條城和織田信忠泊宿的妙覺寺，明智光秀坐鎮三條堀河。
本能寺更是被重重包圍，第一重四天王但馬，第二重村上和泉，第三重三宅式部；且本能寺周圍所有的出口都有2~300人負責把守。
6月1日子時，明智軍完成包圍工作。聽到四周的動靜後，小姓們開始騷亂。信長最初還以爲是侍衛們吵架，剛纔爬起身準備斥責，（就像當初今川義元遭遇偷襲時一樣）忽聽鐵炮發射之聲，陣陣鳴響。
“定然有人反叛，去，看看叛者是誰？！”信長命令小姓森蘭丸說。
森蘭丸出去了一會兒，匆匆跑回稟報：“是桔梗旗印，像是惟任日向守的部隊！”
信長大驚：“光秀嗎……”
“一定會失敗”蘭丸所指的，正是信長麾下大將明智光秀，他當時官位爲正六位下日向守，因曾通過信長向朝廷求得“惟任”的古老姓氏，因此習慣被稱爲“惟任日向守”。
知道明智光秀謀反後，織田信長親自上陣，率小姓衆奮戰，但始終是寡不敵衆。
御馬屋附近馬郎、藤八、巖、新六、彥一、彌六、熊、小駒若、虎若等二十四人戰死。
御殿內小姓森亂、森力、森坊兄弟三人、小河愛平、高橋虎鬆、金森義入、菅屋角藏、魚住勝七、武田喜太郎、大冢又一郎、狩野又九郎、蒲田與五郎、今川孫二郎、落合小八郎、伊藤彥作、久々利龜、種田龜、針阿彌、飯河宮鬆、山田彌太郎、祖父江孫、柏原鍋兄弟、平尾久助、大冢孫三、湯淺甚介、小倉鬆壽等戰死。
織田信長見大勢已去，切腹自殺，但奇怪的是在本能寺內竟然沒有人找到信長的屍體。
信忠率本隊1500人前往救援其父失敗，於京都二條城內自殺。就是這短短兩三個小時改變了整個戰國的歷史。
在受命西援羽柴秀吉，與毛利軍對戰後，明智光秀從安土返回自己的本城近江阪本，五月二十六日再到丹波龜山。翌日，他前往愛宕山參拜，祈禱獲勝。
二十八日，在愛宕山威德院西坊中，召來著名的連歌師裡村紹巴等飲酒唱和，這就是著名的《愛宕百韻》。
當時光秀所做的連歌中有一句意爲：“這細雨綿綿的五月天啊。”然而，土岐在日語中的發音正是“とき”，而明智光秀即出身於土岐氏庶流，如果“とき”確爲雙關語的話，即可解釋成：“五月間，土岐氏取得了天下！”
武田正信在得知織田信長要攻打四國之後就派了使者找上了明智光秀，明智光秀轉變念頭，就是武田正信答應明智光秀，推舉他爲新的太閣。
在織田信長自殺在本能寺之後，武田正信又把消息告訴了羽柴秀吉。
這個時候的羽柴秀吉正在與毛利軍對峙，並且按照竹中重治遺留的計策，水淹了備中高鬆城。