常熟市首例鐮刀菌
【第四屆檢驗與臨牀（感染性疾病）案例展示全國決賽稿件】
作者 |鄧一脈1，顧晨2
單位 |1.常熟市醫學檢驗所 臨牀微生物實驗室，2.常熟市第二人民醫院 手足外科
前 言
患者約兩小時前不慎因車禍致右下肢出血畸形，當即感疼痛劇烈，流血淋漓，給予簡單包紮後送至我院急診就診，X線檢查示:右側外踝骨折，脛骨下端可疑骨折，右膝關節外側及外踝軟組織破損，右側脛骨平臺外側及外踝軟組織異物。爲求進一步診治，急診擬“右膝、踝皮膚軟組織缺損，右側外踝開放性骨折伴骨缺損，右側股骨外側髁骨缺損，右腓總神經損傷，右小腿外側皮膚擦傷”收入病房。
入院診斷右膝、踝皮膚軟組織缺損，右側外踝開放性骨折伴骨缺損，右側股骨外側髁骨缺損，右腓總神經損傷。入院期間多次行外科手術，住院期間創面每日用慶大黴素鹽水沖洗及清潔換藥，結合抗感染補液等綜合治療，創面情況雖然有所好轉，但仍有滲出，傷口不癒合。
5月16日創面分泌物細菌培養的結果爲鐮刀黴屬，究竟是病原體還是污染菌？如果是病原體，是否就是導致創面不愈、滲出的原因？應該進一步採取怎樣的治療方案？如果是污染菌，那麼污染源來自哪裡？應該如何避免該類污染髮生的可能性？
案例經過
如前所述，患者約兩小時前不慎因車禍致右下肢出血畸形，當即感疼痛劇烈，流血淋漓，給予簡單包紮後送至常熟市第二人民醫院急診就診，X線檢查示：右側外踝骨折，脛骨下端可疑骨折，右膝關節外側及外踝軟組織破損，右側脛骨平臺外側及外踝軟組織異物。
爲求進一步診治，急診擬“右膝、踝皮膚軟組織缺損，右側外踝開放性骨折伴骨缺損，右側股骨外側髁骨缺損，右腓總神經損傷，右小腿外側皮膚擦傷”收入病房。患者發病以來無頭痛、嘔吐，無昏迷及抽搐，無發熱，大小便正常，並否認高血壓及糖尿病病史。
住院46天中前後行清創探查骨折支架外固定+創面VSD負壓吸引術，擴創更換VSD+腓總神經探查術，闊筋膜重建外側關節囊外側副韌帶+股前外側島狀皮瓣逆行修復膝關節外，側皮膚軟組織缺損+髂骨重建外踝鋼鋼板固定術+脛後動脈穿支皮瓣修復外踝皮膚軟組織缺損，擴創遊離植皮+小腿近端局部轉移皮瓣+足揹帶蒂皮瓣移植術等。
用藥情況爲：4月1日至26日爲頭孢呋辛1.5g bid ，4月27日~5月13日爲青黴素640萬U q8h。創面分泌物細菌培養結果如下：4月5日產鹼假單胞菌，4月14日無菌生長，4月20、26日及5月6日糞腸球菌，5月11日無菌生長 ， 5月16日鐮刀黴屬，5月23日無菌生長。
鐮刀菌一般入侵免疫缺陷病人造成相關疾病，該病患入院後查血常規正常（粒細胞數值及佔比均正常），無免疫缺陷相關病史，但鐮刀菌廣泛存在於自然界中，該患者是車禍外傷病人，存在暴露史，因此於6月2日病人返院換藥期間，經溝通協調，採集血液標本，進行需培養和G、GM實驗，並採集組織標本直接鏡檢+培養，病理活檢等。
通過直接組織標本鏡檢和組織病理活檢，鏡下均觀察到真菌菌絲等，培養數天後長出菌落，經質譜儀鑑定爲茄病鐮刀菌複合羣，組織標本直接宏基因組二代測序亦爲鐮刀菌屬，最終確診爲茄病鐮刀菌複合羣局部感染感染。
患者經泊沙康唑靜滴一個月後口服序貫，目前傷口癒合較好。
檢驗案例分析
（一）一般檢查：血常規正常，血糖正常，術前傳染性指標（艾滋病、病毒等）均爲陰性。暫無提示存在免疫缺陷相關疾病。
（二）微生物培養：創面分泌物微生物培養結果如下：4月5日產鹼假單胞菌，4月14日無菌生長，4月20、26日及5月6日糞腸球菌，5月11日無菌生長，5月16日鐮刀黴屬（當時尚未安裝微生物質譜儀，直接通過菌落形態和鏡下特點來判斷），由於首次培養出鐮刀菌且爲外傷患者，擔心存在污染的可能性，所以聯繫臨牀重新取樣（創面分泌物），5月23日無菌生長。那麼，5月16日培養出的鐮刀菌究竟是不是該患者創面遷延不愈的病原體呢？
（三）爲明確診斷，採集組織標本檢查，結果如下：
1.組織標本直接鏡檢：採集三個不同部位的組織標本，直接用棉酚蘭染液染色後鏡檢觀察，高倍鏡下直接可觀察到真菌菌絲及疑似鐮刀菌孢子。（圖1）
圖1
2.組織標本真菌培養：採集組織標本後接種在沙保羅平板上，並置於溫度爲35.5℃、CO2濃度爲5.0%的培養箱中。在採樣後的第三天，沙保羅平板上長出真菌菌落，肉眼觀察，菌落質地較爲柔軟，呈白色絨毛狀，邊緣清晰，中心着色深而外緣着色淺。
棉酚蘭染色後，高倍鏡下可見菌絲和大、小孢子，都具有分隔，小孢子短而呈橢圓形，有一個分隔，大孢子有分隔，形似獨木舟，是鐮刀菌的典型特徵。（圖2）此時微生物室剛啓用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS），質譜儀鑑定結果爲茄病鐮刀菌複合羣（Fusarium solani complex）。（圖3）
圖2
圖3
3.鐮刀菌藥敏結果：鐮刀菌對棘白菌素和氟康唑是天然耐藥，兩性黴素B和伏立康唑均敏感的。
4.組織mNGS：將組織標本送檢mNGS，結果提示鐮刀菌屬，序列數1265，相對丰度98.21%。（圖4）
圖4
5. G實驗、GM實驗、血培養：均爲陰性，基本排除了鐮刀菌全身播散性感染。
臨牀案例分析
1.後期又做了組織標本病理活檢：鏡下可見真菌菌絲、化膿性炎，大片壞死滲出組織，肉芽組織和少量纖維結締組織。（圖5）
圖5
2.結合病人病史、症狀、體徵及實驗室檢查結果，患者存在茄餅鐮刀菌複合羣局部感染，診斷較爲明確。雖然病患尚未存在免疫缺陷病症，但是年紀偏大、傷口破損較大，爲防止播散性感染，需要積極系統性治療。
知識拓展
鐮刀菌（Fusarium spp），屬於菌物界真菌門子囊菌亞門肉座菌科（Hypocreaceae）的赤黴屬（Gibberella）、叢赤殼屬（Nectria）、麗赤殼屬（Calonectria）和小赤殼屬（Micronectriella）的有性型真菌。
鐮刀菌廣泛存在於土壤中和植物上，是一種條件致病菌，臨牀上常引起角膜炎[1]，引起皮膚感染及深部感染較爲少見。正如其他許多土壤真菌一樣，它們適應於在土壤中存活，其機能之一是能夠在形態學和生理學上對於新的環境具有很快的變化和適應的能力。它們能夠生活在廣闊範圍的深層底土之中，也可以從許多貯存的食物和化學物品中分離出來。
鐮刀菌病的臨牀表現多種多樣，與菌種及宿主免疫狀態有關，且各個年齡段均可發病，病程長短不一，最長者達22年[2]。皮損可發生在全身任何部位，無特異性。皮損形態呈多形性，可表現爲紅斑、丘疹、潰瘍、結節、疣狀增生等，但以潰瘍和結節改變最多見。當宿主爲免疫缺陷狀態時，易發生播散行感染，有相關報道[3]，患者因料爆炸致全身多處燒傷後血流感染層生鐮刀菌。
實驗研究表明，茄病鐮刀菌是條件致病菌，其致病菌密度越高致病性越強[4]，引發感染最主要的原因是有農作物接觸史或外傷史，當被污染的植物枝葉或土沙等傷及角膜，真菌即有機會侵入，引發感染[5]。有相關報道[6]，患者因皮膚長時間接觸灼熱地面而導致燒傷併發生鐮刀菌感染。
微生物學檢查及組織病理學檢查有助於真菌感染的診斷，一般而言，要在組織內找到真菌菌絲、孢子或菌體，才能確診爲深部真菌感染。Josep等[7]曾報道1例艾滋病患者混合感染兩種鐮刀菌，病理組織切片中也未發現真菌。臨牀上碰到難治性潰瘍、結節伴壞死等皮膚損傷，而常規治療無效時，應考慮到鐮刀菌感染的可能。目前臨牀對鐮刀菌感染研究甚少,尚需更多的臨牀觀察。
鐮刀菌感染的治療目前尚無統一方案。鐮刀菌引起的皮膚感染中,免疫功能正常者多爲侷限性受累，進展緩慢，對治療反應較好，而免疫功能缺陷者進展迅速，易形成播散性感染，對抗真菌治療反應較差。
黃玲玲等[2]研究顯示，採用局部治療聯合全身抗真菌治療，能達到較理想的臨牀治療效果，患者能有明顯好轉或痊癒。鐮刀菌除了對棘白菌素和氟康唑是天然耐藥外，其他抗真菌藥物如伊曲康唑、兩性黴素B、伏立康唑、特比奈芬等可根據具體的藥敏結果來選擇使用。
案例總結
本次案例患者以因“車禍致右下肢出血畸形兩小時”入院，由於常熟地區尚未發現過鐮刀菌感染，且無免疫缺乏相關病症，臨牀送檢的標本只有一次有鐮刀菌屬的培養結果，且鐮刀菌廣泛存在於自然界中，極其容易懷疑檢出的鐮刀菌爲污染菌。但是微生物實驗室通過不斷地跟臨牀溝通，直接參與臨牀採集組織標本，聯合組織病理活檢等，最後鎖定了鐮刀菌屬的局部感染。
本案例提示我們，在發現少見菌檢出時，不可用簡單的慣性思維做出判斷，污染菌或者病原菌均與結合臨牀，不能侷限於檢驗本專業，應將檢驗與臨牀有機結合，才能做出科學嚴謹的診斷，爲患者爭取治療時間的同時，盡力尋求最理想的治療方案。
專家點評
點評專家：陳潔常熟市醫學檢驗所所長、常熟市臨牀檢驗質控中心主任
常熟市醫學檢驗所成立於2010年，是國內首家公立性質的獨立醫學檢驗機構，也是蘇州大市首家通過ISO15189認證的實驗室，率先在區域內實施醫學檢驗資源集約化管理，業務範圍覆蓋全市公立醫療機構和部分民營醫療機構，實現了常熟市醫學檢驗資源城鄉服務均等化。作爲區域檢驗，更是代表了一個地區的檢驗醫學的技術水平。
本案例爲開展真菌鏡檢後，發現的第一株鐮刀菌，對本科室微生物檢驗人員的真菌檢測能力具有很大的挑戰性。5月6日培養到鐮刀菌感染後，作爲一種少見菌，科室工作人員在沒有質譜儀的情況下，對該菌做出了準確的鑑定結果，而且具備臨牀思維，能主動聯繫臨牀，從創面分泌物到組織標本的選擇，到牀邊直接參與並指導臨牀採樣，再到選擇血培養、G實驗、GM實驗等輔助檢驗手段，全程參與整個疾病詢證過程；
最終確定該名免疫力正常者患者爲外傷導致的茄病鐮刀菌複合羣局部感染，爲後期患者的康復治療爭取了時間，具有非常重要的臨牀意義，也是作爲常熟地區微生物檢驗在檢驗水平，尤其是真菌檢測水平的進步和提高，體現了工作人員嚴謹求實的科學態度。
此次病例，常熟市第二人民醫院組織了MDT討論，本所微生物實驗室也組織了全科培訓，對鐮刀菌屬的生物學特性、臨牀疾病等都有了深度的認知。通過此次病例的發現和學習，我們更加體會到作爲臨牀微生物實驗室在日常工作中的四個要點：
第一，不輕易放過少見菌、少見感染病例，隨着檢測手段不斷更新，以及感染性疾病的複雜性，會檢出一些不常見的微生物，我們不能畏難和敷衍，更應該通過探索和學習來填補自己醫學知識的盲區；
第二，實驗室（微生物、病理等）之間應該加強合作，在面對一些疑難病例時，很多情況光靠檢驗手段是達不到診斷目的的，但是可以通過其他實驗室的檢測手段，例如病理、影像等，從這些結果來佐證檢驗結果，並結合檢驗結果來更好地服務臨牀；
第三，臨牀無菌操作、規範採樣是非常重要的，微生物檢驗最重要的是無菌操作和合理選擇臨牀標本，此次病例就能看出，剛開始是創面分泌物標本，數次創面標本的培養結果不一致，當檢出鐮刀菌後更是不能準確地判斷是否是感染菌，後經微生物工作人員的專業建議，採集組織標本進行鏡檢和培養，來明確組織感染情況，並且全程無菌操作，杜絕了採樣過程中污染的可能性；
第四，也是最重要的，微生物應該積極主動地跟臨牀溝通交流，在發現疑難或少見菌時，我們需要第一時間取得臨牀信息，通過採樣過程來排除該菌是否存在污染的可能性，通過臨牀症狀的比對來佐證檢出微生物是否是感染菌。
同時，通過溝通交流也能瞭解臨牀真正的需求，建立信任感，一方面能宣貫微生物標準採樣的重要性，從而保證檢驗前質量，另一方面，也能學習到臨牀知識，豐富知識體系，建立臨牀思維，更好地服務臨牀。
參考文獻
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編輯：李玲 審校：笪文武